［关键字］ 妊娠有关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基?1，10啡罗啉?2，9二羧酸—铕复合物；唐氏综合征
Develop A Direct Solid Phase Lanthane Time?resolved Fluoroimmunoassay Reagent of PAPP?Autilizing PVA
Abstract :Objective To develop a prect solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassayreagent of PAPP?A by synthesizing a complex of z?x?PVA?y?Eu3+. Methods Polyvinylamine was labeled with biotin?streptavipn and europium chelate of 4,7?bis?1,10?phenanthroline?2,9?pcarboxylic?acid. Using labeled PVA complex,We designed two?site sandwich time?resolved fluoroimmunoassay of PAPP?A and evaluated assay characteristics of PAPP?A kit .Results We successed synthesizing a conjuagete of z?x?PVA?y?Eu3+ and a reagent of PAPP?A. Detection limits achieved were 0.7mIU/L.The calibration curve was linear 0?10000mIU/L.Intra? and interassay imprecision was 3.89%?4.96% and 7.35%?9.27%.Recovery was 95.8%?104.2%. Conclusions The conjugate of z?x?PVA?y?Eu3+ synthesizied was reactive ,highly fouorescent. A sorts of kit could be synthesized ,taking advantage of it. The reagent of PAPP?A was potentially suited for use in clinical with highly analytical sensitivity.
Key words: Pregnancy associated plasma protein A;Direct solid phase lanthane time?resolved fluoroimmunoassay; Streptavipn?biotin?Polyvinylamine? europium chelate of 4,7?bis?1,10?phenanthroline?2,9?pcarboxylic?acid; Down's Syndrome
妊娠有关血浆蛋白A是一种高分子α2糖蛋白，20世纪70年代在孕妇血清中被发现［1］。在孕妇血中主要PAPP?A是胎盘滋养层组织分泌，它是一种异源四聚体，由两个分子量为200 000~250 000亚基构成。PAPP?A亚基和两个嗜红细胞主要基础蛋白以二硫键结合而成［2］，在孕妇血中只存在微量游离单体PAPP?A。PAPP?A亚基由1 547个多聚核苷酸构成，包含1个拉长的锌指结构，3个Lin—notch重复序列，与5个短一致重复序列［3］。在体内PAPP?A是一种蛋白酶，主要针对胰岛素样成长因子结合蛋白4和胰岛素样成长因子结合蛋白5起用途。胰岛素样成长因子I在促进细胞分裂和增殖起要紧用途，它主要通过IGF?1受体起用途，IGF?I、II的生物活性受6个高亲和性IDFBP调节［4，5］。PAPP?A主要用于产前筛查唐氏综合征，迄今医学上对此病尚无有效的治疗和预防手段，只能通过产前筛查预防DS儿的出生，但现在拓展的绒毛活检,羊水穿刺及脐带血穿刺均为侵入性检查,有1%～3%的流产率,且办法繁琐,出报告时间长,不适合大范围孕妇的普查,仅限于高危人群的诊断。很多报道觉得PAPP?A可作为DS胎儿产前筛查的的标志物。在15周～20周通过结合孕妇孕周、超声诊断和Freeβ?HCG可以辨别65%～75%，但要在3个月～6个月结合AFP、游离E3与抑制素上述成分可辨别85%～90%［6］。有文献［7］报道PAPP?A在急性冠状动脉综合征的早期诊断有肯定的意义，PAPP?A在ACS病人血清含量＜30 mIU/L，同时结构不同于孕妇体内的PAPP?A且存在动态变化，需要借助超灵敏的办法进行测试。国内PAPP?A的诊断试剂大多为ELISA和PerkinElmer公司生产的解离增强时间分辨荧光免疫剖析试剂，无国产PAPP?A时间分辨荧光试剂。大家借助PVA作为载体结合B下载成本A镧系螯合物合成一种高灵敏的固相时间分辨荧光免疫剖析试剂。为提升测试灵敏度和克服B下载成本A标记抗体使抗体失活的问题，大家引入了生物素?亲和素系统。
1材料和办法
1.1材料
1.1.1试剂4,7二氯磺苯基?1，10啡罗啉?2，9二羧酸［4,7?bis?1,10?phenanthroline?2,9?pcarboxylic acid,B下载成本A自制］；纯化亲和素；硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?己酯类［Sulfosuccinimidyl?6'??6? hexanamido hexanoate，Sulfo?NHS?LC?LC?Biotin， pierce Chemical Company］；聚乙烯胺氢氯化物 ；硼酸钠、二甲亚砜；单克隆抗体依据文献［5］选择Hyb234—5作为测试抗体，mAb 10E1作为捕获抗体；PAPP?A标准品和质控品购于PE公司；鼠IgG。
1.1.2仪器Wallac?1420多标记计数仪；HPLC 硅柱TSK?250尺寸排阻柱；96白色微孔板、亲和素包被板；Amicon可浓缩离心管
1.2办法
1.2.1B下载成本A的制备参见文献具体流程［8～10］。
1.2.2生物素?聚乙烯胺?B下载成本A［x?PVA?y］复合物的构建［11］用0.5 M的碳酸盐缓冲液配制浓度为10 mg/ml聚乙烯胺溶液 ，将200 μg NHS?LC?LC?Biotin溶于20 μl碳酸盐缓冲液中，取200 μl上述PVA溶液加入20 μl上述NHS?LC—LC?Biotin溶液中，振荡混匀，室温反应1.5 h，用0.5 M碳酸盐缓冲液将混合液稀释到1 ml，将固体B下载成本A研磨成粉末状，先在上述1 ml混合液中加入5 mg B下载成本A，用力搅拌，直到溶解，重复加3次B下载成本A，5 mg/次，共计20 mg B下载成本A，在室温放置5 h～6 h，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用0.1 M NaHCO3 5 L透析、过夜、重复透析2次，尽量除去没反应的B下载成本A和生物素。
1.2.3HPLC纯化x?PVA?y复合物离心浓缩上述x?PVA?y复合物到0.3 ml～0.5 ml。流动相0.05 M Tris缓冲液，控制HPLC流速0.8 ml/min，在325 nm处监测层析液，上样后，立刻采集，x?PVA?y在10管～16管约5 ml左右，取10 μlx?PVA?y层析液加入90 μl水滴入亲和素包被板微孔中，温育30 min，洗板，加入用Tris缓冲液配制的10 M～5 M EuCl3 100 μl，反应10 min，洗板、干燥，用Wallac?1420测试Eu3+的荧光强度，没结合复合物的被洗去了，没结合B下载成本A的复合物因没办法结合Eu3+而没荧光，计算标记的PVA，大约每分子结合50个～100个B下载成本A分子。
1.2.4构建亲和素?生物素?PVA?B下载成本A ［z?x?PVA?y?Eu3+］复合物［11］用0.1M Tris缓冲液配制小牛血清白蛋白60 g/L，同时加入EuCl3，使Eu3+浓度为10-6 mol/ml，用双蒸水配制亲和素溶液浓度为1 mg/ml，取上述BSA溶液1 ml，加入10 μl亲和素溶液，再加入50 μl的x?PVA?y复合物，混匀，55 ℃温育1.5 h，4 ℃保存备用。
1.2.5z?x?PVA?y?Eu3+复合物反应活性用生物素化的各种浓度鼠IgG包被96孔微板，用60 g/L BSA和0.1 mol/L Tris缓冲液10倍稀释z?x?PVA?y?Eu3+复合物，在板的微孔中加入100 μl稀释后的z?x?PVA?y?Eu3+复合物，室温反应30 min，洗板、干燥，测量荧光强度。本实验是验证复合物的反应活性。
1.2.6生物素标记10E1抗体［12］用二甲亚砜制备硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?乙酯溶液，将抗体10E1溶于0.1 mol/L硼酸钠溶液，每1 mg抗体中加硫代琥珀酰亚氨?6生物素氨基?己酯类溶液210 μg混合，室温放置4 h，在上述溶液中加入20 ml 1 mol/L NH4Cl，室温反应10 min，将反应液进行透析，除去未结合的生物素，将抗体浓度用剖析缓冲液配置成8 ng/μl，-20 ℃保存备用。
1.2.7单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板将抗体溶于0.1 M磷酸盐缓冲液，配置成5 μg/ml抗体溶液，在每一孔中加入80 μl抗体溶液，室温反应20 h，然后用生理盐水洗3次，然后每孔加120 μl 0.05 M Tris?Hcl 缓冲液浸泡2 h。吸干缓冲液，干燥，密封4℃保存。
1.2.8样本采集、定标、灵敏度、精密度和收购实验剖析过程选取怀孕8周、9周、11周妇女血清各一份，经PE企业的DELFIA试剂和D&G企业的ELISA试剂多次精准测定，值分别为：P1 863.27 mIU/L；P2 1 273.63 mIU/L；P3 2 727.23 mIU/L。用标准品稀释液将标准品稀释浓度为：S0 0 mIU/L、S1 20 mIU/L、 S2 200 mIU/L 、S3 1 000 mIU/L 、S4 5 000 mIU/L 、S5 10 000 mIU/L。标准品定标依据WHOIRP78/610，单位换算：1 000 mIU/L=4.5 μg/ml。在单克隆Hyb234—5抗体包被96孔微滴定板，每孔加入定标液10 μl，作8次平行测量，加入50 μl生物素标记10E1抗体50 μl，混匀，36 ℃，室温反应20 min，洗板6次，加入100 μl 10倍稀释的z?x?PVA?y?Eu3+复合物，室温反应25 min，洗板6次，吹干，Wallac?1420测量荧光强度，取均值，作标准曲线。将S0 0 mIU/L做20次重复测试，计算均值和标准差，以X +2s为试剂的最小测试限。将Control1，Control2 ，Control3 依据定标剖析过程，同批测量20次，批间测量12次，用于评价精密度。对采集样本依据定标剖析过程进行测量，然后将Control1、Control2、Control3分别等体积加入P1 、P2、P3中进行测量，用于评价收购实验。
[1][2]下一页
